Szlak sygnałowy morfogenu Sonic Hedgehog (SHH) w okresie embrionalnym jest wysoce zaangażowany w regulację migracji i specyfikacji wielu populacji komórek. Po okresie embrionalnym aktywność szlaku HH jest wyciszana, ale oddziaływuje na populacje komórek progenitorowych, kontroluje regenerację, naprawę i funkcje pewnych tkanek. Aktywacja o różnym tle i zmiany molekularne elementów ścieżki SHH występują w wielu nowotworach, gdzie onkogenna sygnalizacja wywiera wpływ na komórki nowotworu i podścielisko. Niekontrolowana sygnalizacja szlaku może wynikać z genetycznie lub funkcjonalnie uwarunkowanej zmienionej ekspresji genów i białek będących jego elementami, a nadekspresja białek działa autokrynnie lub parakrynnie. Transmisja sygnału szlaku HH może odbywać się także poza drogą klasyczną poprzez interakcję z innymi ścieżkami metabolicznymi. Istnieją nowoczesne metody terapii celowanej ukierunkowanej na zmutowane i/lub nadmiernie aktywne elementy tego szlaku. Guzy germinalne (germ cell tumours – GCT) są heterogenną grupą nowotworów gonadalnych i pozagonadalnych, podzielonych na kilka typów pato- biologicznych. Pomimo kompleksowego leczenia onkologicznego, problem wznów i lekooporności ze złym rokowaniem dotyczy 20% dzieci ze złośliwymi GCT. Guzy te wywodzą się z pierwotnych komórek płciowych, które w embriogenezie wędrują wzdłuż zarodka do zawiązków gonad, a m.in. sygnalizacja SHH wpływa na migrację gonocytów, kształtowanie i funkcjonowanie gonad. Zmiany molekularne w GCT wieku rozwojowego nie są dobrze poznane, a badań kompleksowych szlaku SHH w tych nowotworach dotychczas nie przeprowadzano. Hipoteza projektu zakładała, że szlak SHH jest zaktywowany w GCT odgrywając auto i parakrynną rolę w patogenezie i przebiegu tych guzów u dzieci. Postulowano też, że mechanizmem aktywacji są zmiany w kluczowych genach szlaku, zwłaszcza w potencjalnych molekularnych podtypach guzów.
Celem projektu było zbadanie stanu aktywacji szlaku SHH w GCT u dzieci, z uwzględnieniem zmian molekularnych i ekspresji jego genów i białek oraz wyłonienie nowych czynników prognostycznych i predykcyjnych w oparciu o analizę związków molekularno- patoklinicznych w badanej grupie. Badania planowano przeprowadzić na około 120 guzach GCT od pacjentów z kilku ośrodków onkologii dziecięcej. Celem badań klinicznych było zbieranie szczegółowych danych. Badania morfologiczne zaplanowano uwzględniając szczegółową ocenę histologiczną i ocenę IHC ekspresji wybranych białek szlaku. Badania molekularne – ocena ekspresji kluczowych genów; analiza występowania mutacji dla kluczowych i funkcjonalnie powiązanych genów szlaku SHH. Badania na liniach komórkowych. Ocena znaczenia klinicznego uzyskanych badań tkankowych i genetycznych poprzez analizę wzajemnych związków w kontekście wyłonienia czynników prognostycznych i predykcyjnych.
1. Projekt.
Szlak sygnałowy morfogenu Sonic Hedgehog (SHH) w okresie embrionalnym jest wysoce zaangażowany w regulację migracji i specyfikacji wielu populacji komórek. Po okresie embrionalnym aktywność szlaku HH jest wyciszana, ale oddziaływuje na populacje komórek progenitorowych, kontroluje regenerację, naprawę i funkcje pewnych tkanek. Aktywacja o różnym tle i zmiany molekularne elementów ścieżki SHH występują w wielu nowotworach, gdzie onkogenna sygnalizacja wywiera wpływ na komórki nowotworu i podścielisko. Niekontrolowana sygnalizacja szlaku może wynikać z genetycznie lub funkcjonalnie uwarunkowanej zmienionej ekspresji genów i białek będących jego elementami, a nadekspresja białek działa autokrynnie lub parakrynnie. Transmisja sygnału szlaku HH może odbywać się także poza drogą klasyczną poprzez interakcję z innymi ścieżkami metabolicznymi. Istnieją nowoczesne metody terapii celowanej ukierunkowanej na zmutowane i/lub nadmiernie aktywne elementy tego szlaku. Guzy germinalne (germ cell tumours – GCT) są heterogenną grupą nowotworów gonadalnych i pozagonadalnych, podzielonych na kilka typów pato- biologicznych. Pomimo kompleksowego leczenia onkologicznego, problem wznów i lekooporności ze złym rokowaniem dotyczy 20% dzieci ze złośliwymi GCT. Guzy te wywodzą się z pierwotnych komórek płciowych, które w embriogenezie wędrują wzdłuż zarodka do zawiązków gonad, a m.in. sygnalizacja SHH wpływa na migrację gonocytów, kształtowanie i funkcjonowanie gonad. Zmiany molekularne w GCT wieku rozwojowego nie są dobrze poznane, a badań kompleksowych szlaku SHH w tych nowotworach dotychczas nie przeprowadzano. Hipoteza projektu zakładała, że szlak SHH jest zaktywowany w GCT odgrywając auto i parakrynną rolę w patogenezie i przebiegu tych guzów u dzieci. Postulowano też, że mechanizmem aktywacji są zmiany w kluczowych genach szlaku, zwłaszcza w potencjalnych molekularnych podtypach guzów.
Celem projektu było zbadanie stanu aktywacji szlaku SHH w GCT u dzieci, z uwzględnieniem zmian molekularnych i ekspresji jego genów i białek oraz wyłonienie nowych czynników prognostycznych i predykcyjnych w oparciu o analizę związków molekularno- patoklinicznych w badanej grupie. Badania planowano przeprowadzić na około 120 guzach GCT od pacjentów z kilku ośrodków onkologii dziecięcej. Celem badań klinicznych było zbieranie szczegółowych danych. Badania morfologiczne zaplanowano uwzględniając szczegółową ocenę histologiczną i ocenę IHC ekspresji wybranych białek szlaku. Badania molekularne – ocena ekspresji kluczowych genów; analiza występowania mutacji dla kluczowych i funkcjonalnie powiązanych genów szlaku SHH. Badania na liniach komórkowych. Ocena znaczenia klinicznego uzyskanych badań tkankowych i genetycznych poprzez analizę wzajemnych związków w kontekście wyłonienia czynników prognostycznych i predykcyjnych.
2. Osiągnięcia:
2.1. Stworzenie kliniczno- patologicznej bazy danych obejmującej 154 guzów germinalnych dziecięcych, będącymi guzami rzadkimi, co stanowi największy zbiór w Polsce i jedną z największych kolekcji tych guzów w onkologii dziecięcej w Europie.
2.2. Przeprowadzenie po raz pierwszy kompleksowej oceny immunohistochemicznej białek szlaku SHH (SHH, IHH, PTCH1, SMO, SUFU, Gli1, Gli2, Gli3, Zic2) w oparciu o wypracowaną własną metodykę histotechnologiczną, w grupie 105 guzów z uwzględnieniem populacji komórek nowotworowych i podścieliska oraz analizy jakościowej i ilościowej odczynów przy użyciu cyfrowego analizatora obrazu.
Przeprowadzenie powyższych odczynów jako dodatkowych badań w grupie guzów germinalnych od pacjentów dorosłych. Ujawnienie związków immunoekspresji z histologią guzów, specyficznej lokalizacji subkomórkowej białek oraz różnic z tkankami normotypowymi.
2.3. Przeprowadzenie molekularnej analizy guzów na materiale mrożonym (a.) i parafinowym (b. – e.) w oparciu o opracowaną dedykowaną indywidualnie opracowaną metodykę:
a. array CGH w podgrupie 13 wewnątrzczaszkowych guzów germinalnych. Analiza porównawcza profili genomowycch wykonana z wykorzystaniem techniki mikromacierzy-CGH+SNP (aCGH) o rozdzielczości 80 kB. Jedyne tego typu badanie w grupie wyłącznie wewnątrzczaszkowych guzów dziecięcych (wiek 0-18 l.).
b. pionierska analiza ekspresji genów w pilotażowej podgrupie różnych podtypów histologicznych guzów i tkanek kontrolnych (30) – z wykorzystaniem techniki PCR (rtPCR) z użyciem panelu do badania ekspresji 84 kluczowych genów związanych ze szlakiem (Hedgehog Signaling Pathway RT2 Profiler PCR Array; Qiagen), w celu wytypowania genów do dalszej analizy na większej grupie. Ujawniono różnice w ekspresji pewnych genów zależnie od podtypu histologicznego i lokalizacji guza oraz wieku pacjentów.
c. badania ekspresji genów (SMO, GLI1, HHIP, GLI3, PTCHD1, ERBB4, FGFR3, WNT3, FGF9, ZIC1, ZIC2, LRP2, WIF1) i zmian na poziomie DNA w oparciu o NextSeq Illumina w 102 przypadkach;
d. analiza mutacji w grupie 74 guzów. Ocenę zmian somatycznych w genach związanych ze ścieżką Hh przeprowadzono za pomocą techniki sekwencjonowania następnej generacji (NGS) z użyciem specjalnie zaprojektowanego przez nas autorskiego panelu 25 genów QIAseq (Qiagen) nacelowanego na sieć HH i geny powiązane;
e. dodatkowy obszar badawczy – pionierska charakterystyka izoform genu BARD1 w trzech podgrupach guzów GCT o jednorodnej histologii (yolk sac tumor, dysgerminoma, teratoma), w porównaniu do neuroblastoma i rhabdomyosarcoma. Pojedyncze doniesienia ujawniają powiązania genu supresorowego BARD1 ze szlakiem SHH.
2.4. Publikacje powstałe na podstawie wyników badań- pięć opublikowanych, jedna złożona do czasopisma, pięć dużych prac w przygotowaniu.
2.5. Prezentacje zjazdowe w Polsce i za granicą – przyjęte z dużym zainteresowaniem, jako nowe podejście do badań nad GCT u dzieci.
Uzyskane wyniki wskazują na zróżnicowaną nadaktywację/ nadekspresję elementów szlaku SHH, która bierze udział w dysregulacji procesów dojrzewania i proliferacji komórek w poszczególnych podgrupach guzów. Tkankowa ekspresja białek szlaku SHH jest częsta w GCT i wiąże się z niektórymi parametrami patologicznymi i klinicznymi, a szczególnie z obrazem histologicznym. Rzadkość występowania powtarzalnych zmian w kluczowych genach szlaku SHH wskazuje, że odgrywają one rolę w patogenezie relatywnie niewielkiego odsetka nowotworów germinalnych u dzieci. W części guzów ujawniono nieopisane dotąd w GCT zmiany genetyczne.
1. Charakterystyka kliniczna grupy badawczej
Zebrana baza danych obejmowała 154 pacjentów z rozpoznaniem guza germinalnego w wieku 0-18 lat, z kilku ośrodków w Polsce (GUMed Gdańsk, IPCZD w Warszawie, UM Poznań, UM Wrocław, WSS Szpital Kielce, CMP Łódź, UJ Kraków), gromadzonych w ramach Zespołu ds Guzów Germinalnych Grupy Roboczej Guzów Litych PTOiHD oraz 7 przypadków z Rumunii. Kompletne dane kliniczne uzyskano w 115 przypadkach. W guzach przeważała budowa histologiczna mieszana (67 guzów), w pozostałych : 17 Yolk sac tumor, 36 teratoma o różnym stopniu, 13 dysgerminoma oraz w 6 Carcinoma embryonale.
Częściej pacjenci w chwili diagnozy byli powyżej 10 roku życia – 65% analizowanych chorych. Wiek 10 lat jest obecnie jednym z ważnych kryteriów rokowniczych u chorych w wieku rozwojowym z tymi nowotworami. Przeważała płeć męska – chłopców było 68, dziewczynek 22. Dominowała lokalizacja gonadalna, jedynie u 28 badanych stwierdzono pierwotną lokalizację pozagonadalną : w okolicy krzyżowo-guzicznej, w śródpiersiu, sercu, ścianie klatki piersiowej, zaotrzewnowo, pochwa. Wszystkie guzy o lokalizacji pozagonadalnej były zdiagnozowane u małych dzieci, poniżej 3 lat i wykazywały najczęściej histologiczną budowę potworniaków w różnym stopniu niedojrzałości lub w 4 przypadkach – budowę typu yolk sac tumor. Jest to zgodne z danymi epidemiologicznymi, które ujawniają, że guzy o lokalizacji pozagonadalnej występują głównie u dzieci najmłodszych. Lokalizację gonadalną stwierdzono u 90 chorych w tym u 27 dziewczynek guz zlokalizowany był w jajniku , a u 63 chłopców w jądrze. U żadnej z analizowanych dziewcząt nie stwierdzono obustronnych guzów jajnika, natomiast u 6 z nich rozpoznano dysgenezję gonad, w tym u jednej z tych pacjentek po wykonaniu kariotypu rozpoznano zespół Turnera, a u pozostałych zespół Swyera. Żaden z chorych chłopców nie wykazywał cech dysgenezji gonad, co nakazywałoby wykonanie badań kariotypu.
Oceniono wielkość guzów wg największego wymiaru guza. W 13 przypadkach brak było danych dotyczących wielkości guza. Wśród pozostałych 77 guzy o wymiarze >10 cm znaleziono u 22 chorych, 5-10 cm u chorych u 32 chorych i < 5 cm u 23 chorych.
Analiza wykazała, że w chwili rozpoznania najczęściej stwierdzano nowotwór w miejscowo zaawansowanym stadium klinicznym (II/III stadium zaawansowania). Nowotwór w stadium I zaawansowania rozpoznano u 29 chorych. Byli to głównie chłopcy z lokalizacją guza w jądrze i w 6 przypadkach dziewczynki. W 35 przypadkach rozpoznano nowotwór w IV stadium zaawansowania z obecnością przerzutów odległych.
Zgodnie z protokołem diagnostyczno-terapeutycznym TGM-95 wg którego chorzy byli kwalifikowani do grup ryzyka na podstawie obecności odległych przerzutów lub wysokiego stężenia markera – AFP w surowicy krwi (>15000ng/ml). W analizowanej grupie 42% należało do grupy wysokiego ryzyka, a 58% do grupy standardowego ryzyka. Wśród chorych wysokiego ryzyka u 45 stwierdzano obecność przerzutów odległych i u 19 wysokie stężenie AFP. U 8% chorych marker AFP nie został oznaczony podczas diagnozy.
W przypadku 83 chorych wykonano również oznaczenie stężenia drugiego markera guzów germinalnych – choriogonadotropiny (βHCG). Przyjmuje się, że stężenie HCG powyżej 5000mU/L stanowi niekorzystny czynnik prognostyczny. Wśród badanych w 10 przypadkach stężenie βHCG było wysokie >5000 mU/l.
W analizowanej grupie chorych brak danych dotyczących odległych wyników dotyczył 15 chorych. Wznowy po chemioterapii pierwszej linii stwierdzono w 11 przypadkach, we wszystkich przypadkach po leczeniu wznowy osiągnięto powtórną całkowitą remisję. Byli to chorzy z guzami o histologii Ca embryonale w 4 przypadkach, w 1 przypadku pacjentka z guzem typu dysgerminoma i dwóch chłopców z guzami mieszanymi jądra. Guzy teratomatyczne krzyżowoogonowe i potworniaki jajnika dojrzałe i G1 leczono wyłącznie chirurgicznie. W 1 przypadku wznowę ujawniono w przypadku zaawansowanego guza okolicy
krzyżowo-guzicznej o budowie teratoma immaturum z elementami teratoma malignum. Ponadto zgromadzono grupę 16 pacjentów z GCT w obrębie OUN , wiek 5 miesięcy – 17 lat, 9 germinoma, 4 teratoma, 2- mixed GCT i 1 yolk sac tumor. Wielkość guzów wynosiła do 6,8cm, część guzów poddanych było wyłącznie biopsji przed chemioterapią. Jeden pacjent zmarł, a jeden miał progresję po pierwszej linii leczenia.
Zebrana grupa guzów reprezentuje heterogenność tych nowotworów u dzieci i koresponduje z grupami pato- biologicznymi GCT. Efekty leczenia są zbliżone do współczesnych danych z literatury. Część guzów diagnozowana jest w zaawansowanym stadium. W części przypadków nie wykonano oznaczenia markerów w surowicy.
2. Badania immunohistochemiczne (IHC)
Badania wykonano na mikromacierzach tkankowych z guzów dziecięcych o homogennym utkaniu (42 guzy) oraz na pełnych skrawkach z 63 guzów dziecięcych. Ponadto na TMA w 47 guzach od dorosłych. Wykonano odczyny IHC z przeciwciałami: SHH, IHH, Gli1, Gli 2, Gli3, PTCH1, SMO, SUFU, SOX2 i Zic2 (przeciwciała Abcam, Novus Biological, w oparciu o własne wypracowane indywidualne i zoptymalizowane protokoły, wizualizacja EnVision DAKO Agilent). Ocena IHC w skali własnej (0-3), z uwzględnieniem lokalizacji odczynu w komponentach guzów (mixed GCT) i subkomórkowo (jądrowy, błonowy, cytoplazmatyczny), z wykorzystaniem cyfrowego analizatora obrazu do części odczynów w celu obiektywizacji obserwacji. W normalnej gonadzie
męskiej i żeńskiej profil ekspresji zależał od wieku pacjenta (prepubertal vs postpubertal) oraz typu komórek. Medulloblastoma SHH- activated prezentowały powtarzalny profil ekspresji. W carcinoma embryonale, yolk sac tumor i dysgerminoma stwierdzono wysoką ekspresję SHH, PTCH1 i Gli1. Immunoreaktywność SHH dotyczyła cytoplazmy i błony komórkowej (poza dysgerminoma gdzie była tylko cytoplazmatyczna), PTCH miało ekspresję jądrową, a Gli1 jądrowo- cytoplazmatyczną (poza dysgerminoma gdzie była tylko jądrowa). Odczynowość SMO, SUFU, Gli2 i Gli3 była niska. SMO identyfikowano z różną dominacją subkomórkową, SUFU prezentowało reakcję jądrową. Najsłabszą ekspresję miało białko Gli3. W potworniakach i guzach mieszanych ekspresja białek szlaku była zmienna i zależała od komponentu tkankowego i dojrzałości tkanek. W odniesieniu do nabłonków, widać było
odmienny profil w nabłonku płaskim niż gruczołowym, ale zmienność dotyczyła też różnych rodzajów nabłonka gruczołowego (jelitowy, trzustka, ślinianka, gruczoły łojowe, oskrzele). Podobnie w tkankach mezenchymalnych i elementach podścieliska, naczyniach i komórkach odczynu zapalnego. Neuropeithelium zależnie od swej dojrzałości miało różną odczynowość dla elementów szlaku, w niedojrzałych ujawniało najwyższy odczyn dla ZIC2 i niski SHH.
Wnioski: GCT wykazują heterogenną tkankową ekspresję białek szlaku SHH związaną z ich histologią. Silny jądrowy odczyn Gli1 świadczy o aktywacji szlaku w guzach GCT. Ekspresja SHH w komórkach nowotworowych i elementach podścieliska guzów sugeruje jego auto i parakrynną rolę w aktywacji szlaku. Nie stwierdzono różnicy pomiędzy ekspresją białek w guzach monomorficznych, a korespondujących komponentach w guzach mieszanych.
3. Badania CGH iGCT
Analizę porównawczą profili genomowych wykonano z wykorzystaniem techniki mikromacierzy-CGH+SNP (aCGH) o rozdzielczości ~80kB na matetriale mrożonym grupy 13 śródczaszkowych guzów GCT o różnym typie histologicznym. W ponad połowie (62%; 8/13) badanych przypadków wewnątrzczaszkowych GCTs stwierdzono niezrównoważenie genomu pod postacią mnogich zmian liczbowych i strukturalnych. Najczęstszymi zmianami liczbowymi były: trisomie chromosomu 21 i 19 oraz monosomie chromosomu 13 i 18. Najczęściej występująca aberracja strukturalna dotyczyła fragmentu krótkiego ramienia chromosomu 12 (3/13; 23%
guzów). Najczęstsze zmiany liczby kopii genów szlaku Hh dotyczyły genów PTCH1 (locus 9q22.32) oraz ZIC2 (locus 13q32.3). Potworniaki nie wykazywały zmian. Immunohistochemicznie stwierdzono reaktywność SHH oraz wykładniki aktywności szlaku w komórkach nowotworowych.
4. Badania ekspresji genów
Analizę ekspresji genów szlaku Hh wykonano z wykorzystaniem techniki PCR w czasie rzeczywistym (rtPCR) z użyciem panelu do badania ekspresji 84 kluczowych genów związanych ze szlakiem (Hedgehog Signaling Pathway RT2 Profiler PCR Array; Qiagen) w grupie pilotażowej 30 guzów. Analiza stopnia ekspresji genów wykazała różnice w profilach ekspresji dla kanoniczych białek szlaku Hh pomiędzy poszczególnymi podtypami histologicznymi GCTs. Poziomy ekspresji kluczowych genów szlaku nie były niższe niż poziom stwierdzany w kontrolnej tkance prawidłowej, natomiast dla niektórych z nich stwierdzono istotną nadekspresję w tkance nowotworowej. Porównanie profili ekspresji wykazało również istotne różnice w porównaniu do Shh-aktywnego podtypu medulloblastoma co wskazuje na odmienną aktywność szlaku w przebiegu nowotworzenia tych dwóch grup guzów. Zaobserwowano istotne różnice w ekspresji genów SMO, GLI1, HHIP, GLI3, PTCHD1, ERBB4, FGFR3, WNT3, FGF9, ZIC1, ZIC2, LRP2, WIF1. W następnej partii 96 guzów przeprowadzono celowaną analizę ekspresji wybranych genów NextSeq Illumina. Najczęściej wzrost ekspresji dotyczył dwóch genów, które były istotnie podwyższone w czterech podtypach histologicznych GCTs: ERBB4 (yolk sac; teratoma maturum i immaturum; carcinoma embryonale) oraz PTCHD1 (teratoma immaturum; dysgerminoma; guzy mieszane; carcinoma embryonale) oraz FGF9, ZIC2, FGFR3, LRP2, WNT3, BMP7, RUNX2 . Najczęściej obserwowane obniżenie ekspresji występowało jednocześnie w pięciu podtypach histologicznych GCTs i dotyczyło dwóch genów: BCL2 oraz PRKACB. Clustergramy umożliwiają rozróżnienie i pogrupowanie poszczególnych typów histopatologicznych GCTs, jednakże nie wszystkie przypadki danego typu wykazują spójny profil ekspresji badanych genów. Uzyskane wyniki wskazały na udział w patogenezie/ patobiologii GCTs niektórych białek szlaku SHH oraz białek powiązanych funkcjonalnie z działaniem/ aktywnością SHH.
5. Analiza DNA kluczowych elementów szlaku HH i genów kooperujących
Ocenę zmian somatycznych w genach związanych ze ścieżką Hh przeprowadzono za pomocą techniki sekwencjonowania następnej generacji (NGS) z użyciem specjalnie zaprojektowanego panelu QIAseq (Qiagen). Geny szlaku Hh oraz białek szlaków współdziałających z sygnalizacją Hh są niedoreprezentowane w aktualnie stosowanych komercyjnie „panelach nowotworowych” mających na celu ocenę obecności wariantów sekwencyjnych zarówno związanych z ewentualną predyspozycją dziedziczną do rozwoju nowotworów jak wykrycia klinicznie istotnych zmian somatycznych w tkance guza.
Z uwagi na powyższe, dla potrzeb niniejszego badania zaprojektowano własny autorski panel 25 genów. W ramach panelu analizą objęto całą sekwencję kodującą wraz z flankującymi sekwencjami intronowymi 12 genów kodujących kluczowe jak i pomocnicze elementy szlaku Hedgehog, tzn. geny kodujące ligandy (SHH, IHH, DHH), receptory/koreceptory (PTCH1, PTCH2, SMO, LRP2), regulatory (SUFU, HHIP) oraz czynniki transkrypcyjne (GLI1, GLI2, GLI3). Ponadto, do panelu włączono kolejnych 7 genów wytypowanych na podstawie wyników analiz ekspresji: PTCHD1, DISP2, ZIC1, ZIC2 potencjalnie związanych z poprawnym funkcjonowaniem ścieżki jak również niepowiązanych bezpośrednio, ale współdziałających z Hh produktów genów ERBB4 oraz F
GFR3. Ponadto, na podstawie przeglądu danych literaturowych opisujących zmiany somatyczne w GCTs do panelu dołączono również sekwencje kodujące genów: KIT, KRAS, NRAS, HRAS, CBL, MTOR, PTEN.
Do sekwencjonowania techniką NGS użyto DNA wyizolowanego z tkanek w blokach parafinowych, które z uwagi na sposób procesowania preparatów FFPE jest zawsze w pewnym stopniu pofragmentowane. Dlatego też, celem uniknięcia raportowania wyników fałszywie dodatnich będących wypadkową słabej jakości wykorzystanego do badania DNA, w analizie zastosowano restrykcyjne punkty odcięcia w raportowaniu znalezionych wariantów. Raportowano jedynie warianty o pokryciu >100x dla danego regionu oraz o częstości występowania zmienionego allelu (VAF) >5%. Jedynym odstępstwem od tej reguły była reanaliza regionów hot-spot w genie KIT, w celu oceny obecności znanych wariantów patogennych w obrębie fragmentów o pokryciu <100x (przy ilości sczytań dla analizowanego allelu >10). Przy ocenie wariantów mozaikowych, jako minimalne ustalono spełnienie co najmniej jednego z następujących kryteriów: obecność co najmniej 10 sczytań dla analizowanego wariantu lub jego częstość ≥10% VAF. Analiza 70 guzów GCTs wykazała obecność 67 zmian molekularnych, w tym 44 mutacji patogennych oraz 23 wariantów sekwencyjnych o nieznanym znaczeniu klinicznym w tym (ultra)rzadkich wariantów polimorficznych. Zmiany molekularne obecne były w 65% badanych przypadków, przede wszystkim w podgrupach dysgerminoma oraz w guzach
mieszanych. Najczęściej zmiany patogenne stwierdzono w genie KIT (n=23 guzów; 33%; por. niżej) zaś wśród genów związanych ze szlakiem Hh najwięcej wariantów sekwencyjnych opisano w obrębie genu LRP2 (20%).
Spośród wariantów o potencjalnie patogennym znaczeniu klinicznym w genach kodujących kanoniczne białka szlaku stwierdzono znany wariant somatyczny c.2561-1G>A w genie PTCH1 (COSM96966) w guzie pęcherzyka żółtkowego jak i dwa nowe warianty c2773del oraz c.391G>T (p.Glu131*) oraz dwa warianty w rodzinie genów GLI: wariant c.3281C>T (p.Ser1094Phe) w genie GLI1 (COSM24658) w potworniaku niedojrzałym zlokalizowanym w przestrzeni zaotrzewnowej oraz wariant c.451G>A (p.Ala151Thr) w genie GLI2 (COSM1208285). Spośród zmian dotychczas niepisanych w bazie COSMIC, które w świetle przeprowadzonych analiz in-silico mają wysoce prawdopodobny charakter patogenny w niniejszym badaniu stwierdzono: dwa warianty sekwencyjne w
genie DISP2: dotychczas nieopisany wariant c.937C>T (p.Gln313Ter) o VAF 10% w germinoma OUN oraz c.2212C>T (p.Gln738*) o VAF 24% w guzie mieszanym jądra. Ponadto opisano wariant c.1604G>A (p.Trp535*) w genie SMO również w guzie mieszanym jądra oraz c.1360G>A (p.Asp454Asn) w genie HHIP w dysgerminoma jajnika. Stwierdzono również obecność nowych wariantów sekwencyjnych o nieznanym znaczeniu klinicznym w genach DHH c.1111 C>T (p.Pro371Ser) w potworniaku niedojrzałym okolicy krzyżowo-guzicznej; SUFU c.1070C>T (p.Pro357Leu) w guzie mieszanym jądra oraz w genie ZIC2 c.58C>T (p.His20Tyr) w dysgerminoma jajnika oraz trzech znanych wariantów o niepewnym znaczeniu klinicznym: c.506T>C (p.Pro169Leu; COSM33095),
c.2542G>A (p.Asp848Asn; COSM1568985) oraz germinalnym c.595C>T (p.Pro199Ser) w GLI3 (COSM1698607) w guzach mieszanych jądra. Ponadto w 17 guzach stwierdzono obecność dotychczas nieopisanych zmian w obrębie sekwencji genu LRP2, co związane jest prawdopodobnie z rozmiarem genu (największym z analizowanych w niniejszym projekcie) jak i dotychczas jego mało poznaną rolą pełnioną w procesach fizjologicznych i patologii chorób człowieka, które uniemożliwiają jednoznaczną ocenę charakteru stwierdzonych wariantów. W genach kodujących białka współpracujące ze szlakiem Hh również wykazano obecność znanych wariantów patogennych, przede wszystkim w genie KIT w n=23 (33%). Warianty te stwierdzono w większości analizowanych przypadków należących do grup histologicznych dysgerminoma oraz guzów mieszanych. Warianty sekwencyjne w genie KIT zlokalizowane były typowo w tzw. regionach krytycznych genu (ang. hot-spot) w eksonie 9, 13 a zwłaszcza 11 i 17
(mutacje w obrębie kodonu p.Asp816 stwierdzono 4 przypadkach). W siedmiu guzach stwierdzono również znane warianty patogenne w genach w HRAS i KR AS w regionie hot-spot (p.Gly12 oraz p.Gly13) w tym w jednym przypadku współwystępującym z wariantem w genie KIT. Ponadto, w dwóch guzach (mieszanym oraz teratoma immaturum) stwierdzono obecność wariantu c.49C>T (p.Gln17*; COSM5153) w genie PTEN; zaś w guzie mieszanym jajnika stwierdzono wariant c.2012G>A w genie FGFR3 (COSM1428733). W guzie mieszanym jądra stwierdzono dotychczas nieopisaną zmianę c.1033C>T (p.Gln345*) w genie CBL.
Uzyskane dane wskazują na selektywną aktywację pojedynczych elementów szlaku SHH, która bierze udział w dysregulacji procesów dojrzewania i proliferacji komórek, a rzadko jest czynnikiem spustowym odpowiedzialnym za proces onkogenezy guzów germinalnych.
6. Badania izoform genu BARD1 w GCT w kontekście poznania różnic między podtypami guzów.
Zbadano material FFPE 9 guzow yolk sac, 7 teratoma i 8 dysgerminoma. W tkance nowotworowej w podtypie Yolk sack tumor stwierdzono wyższą ekspresje izoformy beta genu BARD1 oraz genu TERT niż w zdrowej tkance okalającej. Ustalono, że wzrost ekspresji izoformy beta w tych nowotworach koreluje z wzmożoną ekspresją genu TERT na poziomie znamienności statystycznej. Zależności tych nie wykryto w podtypie teratoma i dysgerminoma.
Przeprowadzone badania są pierwszym na świecie kompleksowym opracowaniem dotyczącym szlaku Sonic Hedgehog w GCT wieku rozwojowego na dużej grupie pacjentów w wieku 0-18 lat. Wyniki projektu pogłębiły wiedzę o niepoznane dotąd aspekty biologii tych specyficznych guzów, ujawniając rolę ścieżki SHH związaną z morfogenezą i różnicowaniem tych nowotworów. Projekt pozwolił na określenie stanu i patomechanizmów aktywacji szlaku SHH oraz związków sygnalizacji z obrazem pato- klinicznym heterogennej grupy GCT. Ponadto zrealizowano pionierskie badania ekspresji izoform genu BARD1 ujawniając w grupie Yolk sac wyższą ekspresję niż w tkankach zdrowych i korelację izoformy beta i genu TERT. W przygotowaniu są artykuły zespołu projektowego dotyczące: szczegółowej analizy ekspresji genów, immunohistochemicznej oceny guzów oraz analizy zmian molekularnych w oparciu sekwencjonowanie techniką NGS, wreszcie kompleksowa kliniczna praca o charakterystyce zbioru guzów GCT, jak i manuskrypt nt. charakterystyki izoform BARD1 w guzach dziecięcych. Zidentyfikowane podczas badań zmiany molekularne i profile ekspresji charakteryzują podtypy guzów germinalnych, stanowiąc obszar nowej wiedzy- potencjalną podstawę do opracowania nowych sposobów leczenia.